Dicas para restauração do desempenho de Coluna Cromatográfica de HPLC

Uma coluna de HPLC é capaz de ter um desempenho altamente reproduzível mesmo após vários meses de uso. No entanto, tem uma vida finita e, ao longo do tempo, seu desempenho começa a diminuir, como evidenciado pela distorção das formas de pico e resolução, entre eles o aumento errático na contrapressão da coluna e aparência de picos fantasmas. Tais anormalidades podem ser evitadas pela adoção de algumas práticas recomendadas de restauração e cuidados de colunas de HPLC.

Uma coluna pode ser restaurada se ela for contaminada devido a sobrecarga ou através do uso de fases móveis incompatíveis, mas uma coluna danificada ou que tenha vivido toda sua vida útil não pode ser restaurada e neste caso precisará ser substituída.

Veja abaixo algumas dicas e procedimentos para restauração da sua coluna cromatográfica.

Colunas de fase reversa

A separação de fase reversa é o principal modo operacional usado na maioria das separações por HPLC. As embalagens ou recheios compreendem principalmente às fases estacionárias de C18, C4, CN, NH2 e fenilo. Recomenda-se a eluição com 10 a 20 volumes de solventes na sequência mostrada abaixo:

• Água Ultrapurificada Tipo 1
• Acetonitrila
• Isopropanol
• Heptano
• Isopropanol
• Acetonitrila
• Fase móvel a ser utilizada no método.

O tempo de equilíbrio para as dimensões mais comuns das colunas de HPLC é indicado para referência, assim como:

Dimensão	Fluxo	Tempo
250x 4.6mm	1ml/min	60 min
150X 4.6mm	1ml/min	30min

Fase reversa (Separações de proteínas)

• Lavar com 20 volumes de fase móvel sem tampão
• 0,1% de TFA em água ultrapura
• 0,1% de TFA em acetonitrila / isopropanol (1: 2)
• Equilibrar com a fase móvel a ser usada no método

Colunas de Fase normal (Fases amino, diol, nitro, amino estacionárias)

• Lavar com 20 volumes cada um:
• Heptano
• Isopropanol
• Acetonitrila
• Água Ultrapurificada Tipo 1
• Isopropanol
• Heptano

Armazenamento

Após a regeneração da coluna, ela não deve ser utilizada imediatamente, os seguintes procedimentos de armazenamento são sugeridos:

• Deixar por uma noite – Pode se deixar a coluna fechada e acondicionada com a última fase móvel utilizada.
• 2-3 dias até uma semana – Nivelar a água ultrapurificada tipo 1 para evitar o crescimento microbiano.
• Armazenamento de longo prazo (vários meses) – Armazene e deixe acondicionado em solventes apróticos, como acetonitrila.

Validação antes da utilização

Mesmo após a regeneração, é importante validar o desempenho da coluna restaurada, verificando seus parâmetros de desempenho, como altura equivalente, aos pratos teóricos, fator de assimetria e tempos de retenção usando injeções de compostos padrão.

Suas sugestões e observações com base em suas experiências pessoais são bem-vindas, então deixe seus comentários.

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